基于Oct-4、Sox2、Kif4和c-Myc基因克隆的东北虎体细胞重编程研究

【摘要】作为生物多样性保护的一个重要内容,拯救和保护濒危物种已经成为一个世界性的重大课题,虎(Pantheratigris)作为全球野生动物保护的旗舰种,已日益得到人们的高度关注。东北虎(P.t.altaica)是现存虎亚种中个体最大者,处于东北森林生态系统食物链顶级,在其栖息的自然生态系统中起着至关重要的作用。然而,由于人类的直接猎杀和生存环境的破坏,东北虎野生种群数量锐减,目前野生东北虎只分布在俄罗斯远东地区及中国东北部分地区。在恢复东北虎野外种群及其栖息地的同时,如何运用现代细胞与分子生物学新技术开展其遗传资源的离体保护,已成为国内外虎保护研究中新的热点。本研究通过对东北虎的成纤维细胞系构建、BAC文库构建、特异组织高通量转录组测序分析、全能性基因克隆及慢病毒载体构建、成纤维细胞诱导为多能性干细胞等一系列研究,主要获得了以下研究成果：1采用贴壁培养法和冷冻生物学技术构建了东北虎成纤维细胞系,对所建细胞系质量与生物学特性研究结果表明：体外培养成纤维细胞形态良好,均为典型的长梭型；冻存与复苏后细胞生长经历了潜伏期、指数增长期和平台期,生长曲线呈典型“S”型,细胞群体倍增时间约为30h；细菌、真菌、病毒和支原体等微生物检测均呈阴性；乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶两种同工酶酶谱均具种属特异性,无物种间的交叉污染；二倍体细胞比率为97.83%；6种荧光蛋白基因在细胞中的表达率为9.81%-23.19%；东北虎成纤维细胞系的各项指标均达到美国典型培养物中心(AmericantypeCultureCollection,ATCC)细胞系鉴定标准。2应用低熔点琼脂糖法提取东北虎基因组DNA,T4DNA连接酶构建BAC载体,电转化法构建包含153600个BAC克隆、覆盖率为6.5倍的东北虎BAC文库,其平均插入片段长度为116.5kb,其中空克隆的比例为2.6%,所建东北虎基因组BAC文库可以满足后续的功能基因克隆和物理图谱构建等研究。3应用高通量denovo转录组测序对东北虎肺及胎盘组织总RNA进行测序分析,获得9.2GB的数据,发现长度在548bp-575bp的基因80624条,大约48.3%的基因序列可以在数据库(Nr,Swiss-port,KEGG和COG)中被注释；获得大量的东北虎编码基因,并将编码基因完成注释后进行同源性比对,发现东北虎大量编码基因与家猫基因高度同源；通过GO与Pathway分析,阐述了部分编码基因在特异组织中的网络功能；同时获取了东北虎全能基因Oct4、Sox2、Klf4和c-MycmRNA序列,为体细胞重编程提供理论依据。4应用PCR技术体外克隆东北虎全能基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc,并与慢病毒载体Lv-efla-eGFP-tre-X连接构建慢病毒过表达载体,提取质粒后利用脂质体2000转染到293T细胞中进行包装、收集和浓缩,经病毒滴度测定获得了较高的病毒滴度1.1×108TU/ml。5应用慢病毒侵染法将东北虎Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因转基因到东北虎成纤维细胞中并稳定表达,在诱导14d后获得iPS克隆,对获得的iPS细胞通过细胞免疫荧光、WesternBlot验证干细胞表面标志物Oct-4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-80的表达；染色体核型分析研究东北虎iPS细胞在重编程过程中没有出现遗传变异；realtimePCR分析东北虎iPS细胞在重编程过程中Oct-4.Sox2、Nanog、TERT、Bax、Bcl-xl和P53的表达情况；碱性磷酸酶染色分析证实东北虎iPS细胞高表达碱性磷酸酶；注射免疫缺陷小鼠形成的畸胎瘤证实东北虎iPS细胞体内分化能力；三个胚层的体外定向诱导分化证实东北虎iPS细胞具有体外分化能力。综上所述,本研究通过高通量测序获得的东北虎Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列构建慢病毒表达载体,并在东北虎成纤维细胞中稳定表达后诱导东北虎成纤维细胞重编程为iPS细胞,并具备了全能干细胞的标准,成功地构建了东北虎iPS细胞系。这不仅为东北虎胚胎早期发育提供了细胞模型,而且可以作为遗传资源长期保存,从而使我国在东北虎这一珍稀濒危物种保护上,率先实现了就地保护、迁地保护和离体保护三条保护途径。
【作者】白春雨；
【导师】张明海；关伟军；
【作者基本信息】东北林业大学，野生动植物保护与利用，2014，博士
【关键词】东北虎；成纤维细胞；基因组BAC文库；高通量测序；iPS细胞；

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